In den religiösen und mythologischen Bildern seines letzten Lebensabschnitts erfolgte nochmals eine Steigerung der Bewegungsdynamik und der Expressivität (Dornenkrönung, 1542-1544). Dies tritt auch in einer Reihe mythologisch-erotischer Gemälde zutage, die Tizian für Philipp II. von Spanien schuf: Danaë (um 1553), die Venus und Adonis (1554) und Der Raub der Europa (um 1559 bis 1562). Die Farben seiner Bilder wurden dunkler, der Auftrag breiter und unruhiger, was man auch gut in Der Tod des Aktäon (um 1561), Die Schindung des Marsyas (um 1570 bis 1576) und Nymphe mit Schäfer (um 1574). Diese von Tizian als Gedichte bezeichneten mythologischen Bilder setzten neue Maßstäbe für die Darstellung der Naturgewalten und waren in der Kühnheit der Pinselführung bis ins 20. Jahrhundert unerreicht.
Auch in den religiösen Bildern der letzten Lebensphase, in der der Künstler angesichts der wachsenden Popularität von Tintoretto und Veronese und dem Tod seiner Gefährten Pietro Aretino und Jacopo Sansovino zunehmend vereinsamte, ist eine Tendenz zur Auflösung der Form in Farbe und Licht zu beobachten. Zu den nun häufigen nächtlichen Szenen zählen Verkündigung (1565, San Salvatore, Venedig) und die Dornenkrönung (um 1570, Alte Pinakothek, München). Die resignativ-durchgeistigte Weltsicht des Künstlers wird auch in seinen zwischen 1562 und 1570 geschaffenen Selbstporträts (Gemäldegalerie, Berlin-Dahlem; Prado, Madrid) greifbar. Sein letztes Werk war die Pietà mit den Heiligen Hieronymus und Magdalena (Accademia, Venedig), die ursprünglich für seine eigene Grabkapelle vorgesehen war und von Iacopo Palma il Giovane vollendet wurde.
Tizian starb am 27. August 1576 in Venedig. Sein Werk hat die Entwicklung der europäischen Malerei entscheidend beeinflusst, indem er eine in ihrer Ausdruckskraft gleichwertige Alternative zu dem von Michelangelo und Raffael vertretenen geradlinigen und plastischen Stil entwickelte. Vor allem sein nuanciertes Kolorit und seine asymmetrische Kompositionsweise schufen eine neue Bandbreite von Gestaltungsmöglichkeiten, die sich besonders Peter Paul Rubens, Diego Velázquez, Rembrandt und Eugène Delacroix sowie die Impressionisten zu Eigen machten.
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