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Zur Grundausstattung der HPLC-Apparatur gehören: Lösemittelvorratsgefäße, Hoch-druckpumpen, Manometer, Injektionsblock, Säule, Detektor und Schreiber.
Abbildung 2: Aufbau einer HPLC-Apparatur
3.1. Lösungsmittel (mobile Phase):
Bei der Chromatographie sollte man die mobile Phase nach bestimmten Eigen-schaften auswählen. Sie sollte in Wechselwirkung mit der geeigneten stationären Phase das Gemisch möglichst schnell trennen. Das Lösungsmittel darf mit der Substanz keine Reaktion eingehen. Die Viskosität der mobilen Phase bestimmt den Druck in der Säule mit. Eine niedrige Viskosität des Lösungsmittel bei einer konstanten Flußrate erzeugt einen niedrigeren Druck als ein höher viskoses Lösungsmittel. Der Siedepunkt des Lösungsmittel sollte nicht zu niedrig liegen, da sonst bei bestimmten Arbeitstemperaturen das Lösungsmittel mit dem hohen Dampfdruck Dampfblasen bildet, die vor allem die Pumpen und den Detektor stören.
Das Lösungsmittel sollte für die UV-Detektoren transparent sein. Beim Brechungs-index-Detektor sollte der Unterschied der Brechungsindizes von Lösungsmittel und Substanz möglichst groß sein.
Die Trennung kann auch mit Lösungsmittelgemischen erfolgen.
Eluotrope Reihe:
Jedes Lösungsmittel eluiert (Elution: Ausspülen oder Austreiben adsorbierter Stoffe aus einem Adsorptionsmittel) die Probemoleküle unterschiedlich schnell. Ein Lösungsmittel, das die Probemoleküle schlecht von den aktiven Stellen der stationären Phase verdrängt, ist ein schwaches Lösungsmittel. Im umgekehrten Fall verdrängt ein starkes Lösungsmittel gut die Probemoleküle von den aktiven Stellen der stationären Phase. Die Stärke bzw. Elutionskraft der verschiedenen Lösungsmittel wurde empirisch ermittelt und in eine Reihenfolge vom schwachen zum starken Lösungsmittel gebracht. Die Reihenfolge nennt man eluotrope Reihe. Dabei zeigt sich, daß die Eluenten nach ihrer Polarität geordnet sind. In der Adsorptionschromatographie ist z.B. Wasser ein starkes Lösungsmittel.
3.2. Hochdruckpumpen:
Die Pumpen werden für die Erzeugung des hohen Druckes in der mobilen Phase gebraucht. Es wird ein hoher Druck benötigt, damit die mobile Phase mit einer annehmbaren Geschwindigkeit (Flußrate) durch die Säule, die durch die feinkörnige Säulenfüllung einen hohen Strömungswiderstand entgegensetzt, fließen kann.
Der Arbeitsdruck hängt von den Meßbedingungen ab. Bei Säulenfüllungen mit der Körnung von ca. 10 mm liegt der Arbeitsdruck in der Regel im Bereich von 35 bis 75 bar. Bei einer Körnung von 3 bis 5 mm steigt der Druck auf 80 bis 200 bar. Weiterhin hängt der Arbeitsdruck von der Flußrate des Eluenten ab. Stellt man eine hohe Flußrate ein, so muß die Pumpe einen hohen Druck erzeugen. Für die Trennung mit höheren Temperaturen, die eher die Ausnahme sind, muß darauf geachtet werden, daß der Druck nicht zu hoch steigt.
Meistens ist das obere Drucklimit der Pumpe zwischen 400 und 600 bar.
Pumpentypen:
Die üblichen Pumpentypen in den neueren HPLC-Maschinen sind Kurzhub-Kolben- und Membranpumpen. Die Kurzhub-Kolbenpumpen fördern weitgehend gleichmäßig und intervallfrei. Bei den Membranpumpen ist eine Durchflußregelung zur gleichmäßigen Förderleistung notwendig.
Membranpumpen:
Eine Exzenterscheibe (Scheibe, deren Drehpunkt außerhalb des Mittelpunkts liegt) treibt einen Kolben rasch hin und her. Die Bewegung des Kolbens wird durch Hydrauliköl auf eine Membran übertragen.
Abbildung 3: Funktion der Membranpumpe
Bei der Vorwärtsbewegung des Kolbens (Abb. 3.3) wird die Membran ausgebuchtet und das Lösungsmittel verdrängt. Bewegt sich der Kolben zurück (Abb. 3.4), so wird Lösungsmittel vom Vorrat angesaugt.
Die Kugelventile geben beim Ansaugen und Ausstoßen der mobilen Phase den richtigen Weg frei.
Da das Ansaugen eine gewisse Zeit braucht, fördert diese Pumpe diskontinuierlich. Die Förderung wird gleichmäßiger, wenn man zwei phasen-verschobene Pumpen arbeiten läßt.
Abbildung 4.a: Diskontinuierliche Förderung Abbildung 4.b: Phasenverschobene Förderung
Kurzhub-Kolbenpumpen:
Bei den Kurzhub-Kolbenpumpen verdrängt der Kolben das Lösungsmittel direkt, also ohne Hydraulikflüssigkeit und Membran. Deshalb sind hohe Ansprüche an die Dichtung des Kolbens gestellt. Der Kolben muß gegen mechanische und chemische Korrosion beständig sein. Deshalb besteht der Kolben häufig aus Saphir.
Bei den einfachen Kolbenpumpen, die auch eine kreisförmige Exzenterscheibe besitzen, treten die gleichen Probleme auf, wie bei den Membranpumpen.
Neuere Kolbenpumpen besitzen keine runde, sondern eine nierenförmige Exzenterscheibe ("Cam"), die sich außerdem unregelmäßig schnell dreht.
Abbildung 5: Nierenförmige Exzenterscheibe, "Cam"
In der Position, die man auf der Abbildung 5 sieht, wird der Kolben nach rechts gedrückt und verdrängt das Lösungsmittel. Gelangt der Kolben an Punkt P, so wird der Kolben zwangsläufig, der konkaven Form des Cams folgend, zurückgezogen. Während dieser Phase dreht sich der Cam sehr schnell, so daß der Cam nach 200 Millisekunden wieder bei Punkt P' steht. Die ungleiche Krümmung des Cams bewirkt eine fast konstante Fördermenge (abgesehen von der kurzen Zeit, in der sich der Kolben zurückzieht).
Abbildung 6: Förderung des Cams
3.3. Probenaufgabesysteme:
Bei der Einspritzung ist es wichtig, daß keine Luft in die Säule gelangt. Außerdem sollte die Einspritzung schnell und gleichmäßig erfolgen. Das Probengemisch sollte in die Mitte des Säulenanfangs plaziert werden.
Septum:
Ein Septum ist eine elastische, selbstdichten-de Scheibe aus z.B. Silikongummi, die von einer Nadel durchstochen wird. Das Septum wird nach Art des Lösungsmittels ausgewählt. Septa, die auf der Lösungsmittelseite mit Teflon beschichtet sind, lassen sich universell einsetzen. Die Probelösung wird zunächst in eine Präzisionsspritze aufgenommen. Die Länge der Nadel muß so gewählt werden, daß sie knapp bis zum chromatographischen Bett reicht. Man durchsticht das Septum mit der Nadel und spritzt die Probe ein.
Abbildung 7: Aufbau eines Injektionsblockes
Dosierschlaufe:
Man füllt die Schlaufe mit der Probelösung und dreht dann den Innenkörper mit den Kanälen, um die Schlaufe in den Eluentenstrom zu bringen. Das Elutions-mittel drückt die Probelösung aus der Schleife und befördert die Probe in die Trennsäule. Die Dosierschlaufe ist auswechselbar und man kann ein Dosier-volumen von 1 bis 1000 mL wählen.
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