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3.1. Vorangegangenes
Bereits Ende des 18.Jahrhunderts wurden die Grundlagen für die spätere Klonforschung gelegt. 1875 beschreibt der deutsche Biologe Oskar Hertwig die Verschmelzung von Ei- und Samenzelle beim Seeigel, und gehört mit seinen Forschungen zu den Mitbegründern der Embryologie. 3 Jahre später befruchtet der Österreicher Samuel Schenk Eizellen von Meerschweinchen auf Gebärmutterschleim, und weitere 7 Jahre danach, entdeckt der Biologe Weismann, dass die genetischen Informationen einer Zelle bei Teilung reduziert werden. Seine These war, dass eine befruchtete Eizelle alle Informationen über ein Lebewesen trägt.11
3.2. Anfänge
3.2.1 Erste Klonungsversuche
Versuche, die man tatsächlich als Klonen bezeichnen kann, fanden aber erst Anfang des 20.Jahrhunderts statt. Mit seinen Forschungen an Meerestieren, im Besonderen an Seeigeln, schaffte Adolph Eduard Driesch die erste künstliche Klonung. Zunächst brachte er die Eier eines Seeigels dazu sich bis zum 2-Blastomer-Stadium zu entwickeln. Dann trennte er diese in einer Flasche und ließ sie wachsen. Da sich E. Driesch aber nicht erklären konnte, wieso aus den geteilten Eiern winzige Seeigel entstanden, gab er seine Forschungen auf diesem Gebiet auf. 1944 befruchteten die Amerikaner John Rock und Miriam F. Menkin menschliche Eizellen. 6 Jahre zuvor hatte der bedeutende Biologe Hans Spemann vorgschla-
gen, den Kern einer Froscheizelle zu entfernen und durch einen anderen Kern zu ersetzen. Seine Theorie bestätigten 1952 die amerikanischen Biologen Robert Briggs und Thomas J. King, allerdings ohne seine Forschungen gekannt zu haben. Sie vermehrten Frösche aus den Zellen einer Kaulquappe. Das Experiment schlug zwar fehl, Spemanns Idee hat sich aber trotzdem bestätigt.12
3.2.2. Zellkerntransfer bei Fröschen
Nachdem er 1962 mit seiner Behauptung, er habe aus voll ausdifferenzierten Froschdarmzellen Frösche klonen können, auf mehr Skepsis als auf Vertrauen gestoßen ist, entwickelt John Gurdon 1973 den Zellkerntransfer. Der Entwicklungsbiologe von der Universität Cambridge, verpflanzt Zellkerne aus der Haut erwachsener Frösche in entkernte Froscheier. Obwohl die Tiere noch als Kaulquappen sterben, gilt das Experiment als Beweis dafür, dass Klonen aus Zellen erwachsener Tiere möglich ist.13 Damit war auch der Beweis erbracht, dass die Differenzierung von Zellen reversibel ist. Der Versuch war zwar ein Erfolg, je-
doch ergaben sich nun 2 Probleme. Zum einen haben sich die Kaulquappen nicht zu Fröschen entwickelt, zum anderen funktionierte das Experiment bisher nur bei Amphibien, und nicht bei sonstigen Tieren.
3.2.3. Herstellung uniparentaler Mäuse
1977 verkündet Karl Illmensee, der zu dieser Zeit mit Peter Hoppe im Jackson Laboratorium in Maine gearbeitet hat, er habe uniparentale Mäuse hergestellt, das heißt Mäuse mit nur einem Elternteil. Dies umfasst sowohl Mäuse ohne Mutter, sowie auch Mäuse ohne Vater. Illmensee und Hoppe gingen dabei auf folgende Weise vor. Direkt nach der Befruchtung, bilden sich in der Eizelle 2 Vorkerne, die jeweils einen, entweder mütterlichen oder väterlichen, haploiden Chromosomensatz beinhalten. Aus dem besamten Ei wird nun einer der Vorkerne entfernt, indem er mit einer Pipette herausgesaugt wird. Daraus folgt, dass das Ei jetzt nur einen haploiden Chromosomensatz besitzt. Zur Diploidisierung wird die Zygote über Nacht in einem Kulturmedium gehalten, welches das Pilzgift Cytochalasin B enthält. Cytochalasin B verhindert die Zellteilung und der haploide Chromosomensatz im Ei entwickelt sich zu einem diploiden. Sobald dies geschehen ist, wird das Ei in normales Kulturmedium übertragen, wo es sich zum Blastozysten entwickeln kann.14 Auf diese Weise enthält das Ei nur das Erbmaterial eines Elternteiles, und das daraus entstehende Lebewesen, in diesem Fall Maus, stellt einen Klon des entsprechenden Elternteils dar. Das Experiment funktionierte sowohl für Vater- als auch Mutterlose Tiere, jedoch ist allgemein die Erfolgsquote bei mutterlosen Tieren geringer, da beim Verdoppeln eines haploiden Chromosomensatzes, welches ein Y-Chromosom enthält, ein nicht lebensfähiger YY-Embryo entsteht.
3.3. Die Schafsklone vom Roslin Institute
3.3.1. Megan und Morag
Im Juli 1995 erschufen die Wissenschafter des Roslin Institutes Ian Wilmut und Keith Campbell erfolgreich zwei Schafe, Megan und Morag, aus differenzierten Embryozellen. Die Idee Schafe zu klonen, kam dem schottischen Wissenschaftler im Rahmen seines Gen-Einschleusungs-Projekts. Wilmut hatte erkannt, dass die Einschleusung von Genen in Embryozellen sehr schwierig, und die Erfolgsquote minimal war. Nachdem er aber erfahren hatte, dass Steen Willadsen erfolgreich Kälber aus differenzierten Zellen geklont hatte, unternahm er selbst Versuche die-ser Art, da er wusste, dass Manipulation von Genen differenzierter Zellen im Labor einfacher war, als die von Embryozellen. Das Experiment gelang, nachdem Wilmut und Campbell auf die Idee gekommen waren die Zellzyklen zu synchronisieren.15
Der gesamte Klonungsvorgang wurde als die Roslin Technik bezeichnet, und wird später im Detail erläutert.
3.3.2. Dolly
Am fünften Juli 1996 kam dann das erste, aus einer erwachsenen Zelle entstandene Säugetier zur Welt. Dolly war aus einer vollkommen spezialisierten Drüsenzelle eines 6jährigen Finn Dorset Schafs ge-klont worden. Damit war bewiesen, dass die Diffe-renzierung von Zellen vollkommen reversibel ist. Aus 277 erwachsenen Zellen entwickelten sich 29 zu Embryos, und von diesen 29 Embryos entwi-
Abb.1: Dolly und ihre Leihmutter ckelte sich nur einer weiter, weswegen die Roslin
Methode zwar die bekannteste, jedoch nicht die
verlässlichste ist.16
Um die, kurz nach Dollys Entstehung aufgekommenen, Zweifel zu beseitigen, wurden DNA Vergleiche zwischen Dolly und ihrer Mutter angestellt, aus de-nen hervorging, dass das Erbmaterial beider Tiere identisch war. Die einzigen möglichen genetischen Unterschiede waren der Bau der Mitochondrien, da sich die dazu benötigte mtDNA in der Eizelle befindet, und somit von der Leihmutter kommt, und die Länge der Telomere, da sich diese bei jedem Zellzyklus verkürzen, weil sich die Telomere von Dolly bereits sechs Jahre lang verkürzt haben.17
Die Technik mit der Dolly geklont wurde, ähnelt sehr der Technik die bei der Erschaffung von Megan und Morag angewandt wurde, weswegen sie in diesem Abschnitt ebenfalls noch nicht vertieft wird.
3.3.3. Polly
Genau ein Jahr später erschufen die zwei Wissenschaftler Polly. Das besondere an Polly war, dass sie aus Zellen entstand, die im Labor genetisch verändert wurden. Man hat einem Poll Dorset Schaf eine Hautzelle entnommen, und diese wurde mit einem menschlichen Gen versehen 18, welches das Schaf befähigt, in seiner Milch den menschlichen Blutgerinnungsfaktor X zu bilden, der von Menschen mit Hae-mophilia benötigt wird.19 Der größte Nutzen der sich in den Augen der Wissenschaftler dadurch ergab, war mit Sicherheit die Möglichkeit in Zukunft menschliche Proteine in Massen, und Organe, die bei Verpflanzungen nicht so leicht abgestoßen würden, herzustellen.20
3.3.4. Die Roslin Technik im Detail
Die Roslin Methode, oder wie sie auch genannt wird SCNT, was die Abkürzung für ,,Somatic Cell Nuclear Transfer\" ist, wurde vor allem durch das Klonen von Dolly bekannt, weswegen sie nun an diesem Beispiel erläutert wird.
3.3.4.1. Voraussetzung für die Durchführung
Wilmut und Campbell haben im Rahmen ihrer Forschungen entdeckt, dass die Eizelle sich direkt nach der Befruchtung in die G0-Phase begibt, da sie direkt nach dem Eindringen des Spermiums zunächst mit der Koordination der neu er-
haltenen DNA beschäftigt ist.21 Zudem hat Campbell geglaubt, dass Zellen, wenn sie sich verdoppeln, einem bestimmten Muster folgen, was das Überprüfen und Duplizieren ihrer DNA angeht. Daraus haben die beiden Wissenschaftler ge-
schlussfolgert, dass für eine funktionierende Klonierung von Organismen aus differenzierten Zellen, die Zellzyklen der zu verschmelzenden Zellen angeglichen werden müssten. Aus ihren früheren Forschungen haben sie den Zustand der Zy-
gote direkt vor der Duplikation schon gekannt, und haben somit gewusst, die Zel-len müssten vor der Verschmelzung in die G0-Phase gebracht werden. Außerdem haben sie in bis dahin stattgefundenen Experimenten erkannt, dass sich unbefruchtete Eizellen besser zu Klonversuchen eigenen als befruchtete, da erstere, nach der Entkernung, eher zur Aufnahme eines Fremden Zellkerns geeignet sind als letztere.22
3.3.4.2. Durchführung
Man entnimmt zunächst dem zu klonenden Schaf eine Zelle, in diesem Fall eine Euterzelle. Dann wird diese Zelle in einem Kulturmedium in-vitro-vermehrt, wobei dieser Schritt eigentlich nur bei genetischen Manipulationen der Spenderzelle von Bedeutung ist, da daran die Veränderungen des Erbmaterials studiert und überprüft werden können. Danach wird eine dieser Zellen in ein nährstoffarmes Kulturmedium gelegt. Da die Zelle dadurch nur noch mit den zum Leben notwendigen Nährstoffen versorgt wird, schaltet sie nach und nach die aktiven Gene ab. Sobald nur noch die zum überleben notwendigen Gene aktiv sind, befindet sich die Zelle im G0-Stadium. Daraufhin wird einem anderen, oder auch dem selben, Schaf eine Eizelle entnommen und entkernt. Diese kernlose Oozyte legt man so-
dann für 1-8 Stunden direkt neben die ausgehungerte Spenderzelle, in das nährstoffarme Medium. Dann werden die beiden Zellen mit einem Elektroimpuls behandelt, was zum einen dazu führt, dass sie mit einander verschmelzen, und zum anderen die Entwicklung eines Embryos eingeleitet wird. Diese Technik des Ingangsetzens der Embryonalentwicklung ist nicht die optimalste, da dabei nur sehr wenige Zellen lange genug überleben, um sich zu einem Embryo zu entwickeln. Wenn aber ein Embryo überlebt, wird er in einem Schafsovidukt ungefähr 6 Tage lang ausgebrütet. Es ist zwar auch möglich den Embryo künstlich im Labor auszubrüten, die Erfolgschancen sind in Ovidukten jedoch höher. Schließlich wird der Embryo in den Uterus einer Leihmutter verpflanzt, wo er nach einer, für die Art üblichen, Zeit von 148 Tagen zur Welt kommt.23
3.4. Die Honolulu Technik
Im Juli 1998, verkündete ein hawaiiani-sches Team von Wissenschaftlern es habe 3 Generationen genetisch identischer Mäuse produziert. Die Technik wurde von Teruhiko Wakayama und Ryuzo Yanagi-machi entwickelt. Da sich bei Mäusen die Eizellen im Gegensatz zu Schafen direkt Abb.2:Perry,Yanagimachi, & Wakayama
nach der Befruchtung anfangen zu teilen,
galten diese Tiere zu diesem Zeitpunkt als die am schwersten zu klonenden Säugetiere. Trotz dieser Hürde schafften es die beiden Wissenschaftler ihre Vesuchs-
mäuse mit einer höheren Erfolgsquote zu klonen als die der zwei Schotten. 3 von 100 Versuchen waren erfolgreich im Vergleich zu 1 von 277 ein Jahr zuvor am Roslin Institut. Wakayama benutzte Nervenzellen, Sertolizellen, und Kumuluszellen als Spenderzellen. Der Vorteil dabei ist, dass die ersten beiden Zelltypen sich immer im G0-Stadium befinden. Letztere befinden sich hauptsächlich im G0 und im G1-Stadium, haben sich aber generell als die zuverlässigsten erwiesen. Ähnlich wie in der Roslin Methode benutzen die Wissenschaftler unbefruchtete, entkernte Eizellen, um die Spenderzelle einzufügen. Der Unterschied dabei war derjenige, dass die Spenderzelle nicht extra in-vitro-gezüchtet wurde sondern innerhalb von Minuten direkt in die Eizelle übertragen wurde. Der zu klonende Zellkern wurde durch Mikroinjektion eingeschleust. Bevor diese Technik angewandt wurde starben die Eizellen 4 mal so oft, bereits nach der Injektion. Eine Stunde danach hatte die Oozyte ihren neuen Nukleus akzeptiert. Nach weiteren 5 Stunden, in denen sich die Chromosomen in der Zelle verdichtet hatten, erfolgte die chemische Ak-tivierung der Zellteilung mit Hilfe der Substanz Strontium. Das chemische Kultur-medium beinhaltete außerdem Cytochalasin B, was zugleich die Bildung eines Polkörperchens verhinderte, welcher die Chromosomen sonst teilen würde. Da-nach entwickelte sich die Zygote zu einem Embryo, welcher von einer Leihmutter ausgetragen werden konnte. Nachdem sich Wakayamas Technik bewehrt hatte, produzierte er auch Klone von Klonen, und erlaubte auch anderen Klonen sich auf natürlichem Wege forzupflanzen, was insgesamt die Verlässlichkeit seiner Methode in Bezug auf das Funktionieren, sowie in Bezug auf den Gesundheitszustand seiner Versuchsobjekte, bewies. Mit Hilfe der Honolulu Technik, dem allgemeinen Wissensstand über das Genom der Maus, und der schnellen Reproduktionsfähigkeit, eröffneten sich Langzeitforschern neue Möglichkeiten.24
3.5. Weitere bedeutende Ereignisse
Insgesamt fanden die meisten Ereignisse das Klonen betreffend, erst in den letzten 3 Jahren statt. Außer dem was bereits erwähnt wurde, fanden im Jahr 1998 und später noch einige andere Experimente statt.
3.5.1. Erste transgene Kuh
So wurde im Januar auf der Universität von Massachusetts die erste transgene Kuh geklont. Das Experiment stellt einen weiteren Schritt auf dem Weg zur ge-
zielten Genmanipulation dar, mit dem Ziel die Produktion von menschlichen Proteinen zu vereinfachen.25
3.5.2. Effektive Klonung produktiverer Kühe
Im Dezember des gleichen Jahres klonten Japaner 8 Kälber aus den Zellen einer gesunden und produktiven Mutterkuh, wobei nur 10 entkernte Eizellen dazu verwendet wurden. 5 der entstandenen Tiere entstammen den Kernen von Eierstockzellen, 3 davon von Eileiterzellen. Insgesamt überlebten schließlich nur 4 Kälber, da die anderen 4 kurz nach der Geburt verstarben. Die japanischen Wissenschaftler versicherten aber, dass der Vorgang wiederholbar sei, und dass die Erfolgs- quote dabei vergleichbar ist, mit der Erfolgsquote bei der In-vitro-Fertilisation beim Menschen.26 In Zahlen ausgedrückt liegt der Erfolg mit der neuen Methode, wenn man Eierstockzellen benutzt bei 49%, wenn man Eileiterzellen benutzt bei 23%. Im Vergleich dazu hatte man bei der Dolly Methode Hunderte von Fehlversuchen, und einige amerikanische Wissenschaftler berichteten von Zahlen wie 12%, bei ihren Techniken.27
3.5.3. Projekt zur Klonung eines Mammuts
Im Oktober 1999 starteten Wissenschaftler aus den Niederlanden, Frankreich, Russland und aus den Vereinigten Staaten gemeinsam den Versuch einen Mam-
mut aus einer, vor 23000 Jahren eingefrorenen Probe, zu klonen. Die Studie um-fasst generell eine mögliche Klonung und die Einpflanzung eines daraus entstandenen Embryos in eine Elephantenkuh. Während das Projekt weiter fortgesetzt wird, glauben die Wissenschaftler eher nicht an die Wahrscheinlichkeit noch eine intakte Zelle zu finden, die sich für das Experiment eignen könnte.28
3.5.4. Geklonte Schweine
Im März 2000 wurde dann schließlich die vierte Art von Säugetieren geklont, und zugleich wohl auch das bedeutendste für die Forschung auf dem Gebiet der Organverpflanzungen. Nach Mäusen, Schafen und Rindern, wurden nun auch Schweine von Menschenhand geschaffen. 2 der 5 Schweine entstanden aus den Zellen einer Sau, die restlichen aus einer anderen. Die Mediziner erhoffen sich vom Klonen von Schweinen, durch genetische Manipulation, eines Tages Spender für ,,menschliche\" Organe produzieren zu können. Auf die sogenannte Xenotrans-plantation wird später noch mal genauer eingegangen. Bislang wurden tierische Organe bei früheren zwischenartlichen Transplantationen immer entweder sofort, oder kurz danach abgestoßen. Die einzigen funktionierenden Versuche diesbezüglich waren temporäre Ankoppelungen von Menschen an tierische Organe, die sich außerhalb des Körpers befanden.29
Im August des selben Jahres wurden weitere Erfolge bezüglich der Klonung von Schweinen verkündet, aus den Ergebnissen ging jedoch lediglich hervor, dass die Transplantations-Forschung mehr Hürden als erwartet noch zu bewältigen hat, bevor sie ihr Ziel, die erfolgreiche Xenotransplantation, erreicht.30
3.5.5. Versuch zur Rettung gefährdeter Art
2 Monate später kamen Wissenschaftler auf die Idee eine gefährdete Art zu ret-
ten. In dem Fall sollte es ein Gaur sein. Ein Gaur ist ein hochrückiges, südost-asiatisches Wildrind, und ist wegen sei-ner Ähnlichkeit zu Kühen gut für eine zwischenartliche Klonung geeignet. Die
Abb.3:Ein Gaur DNA des Tieres wurde in die entkernte
Eizelle einer Kuh in Iowa eingesetzt.
Nachdem die Eizelle sich zu einem Embryo entwickelt hatte, wurde dieser von einer Leihmutterkuh ausgetragen. Die erfolgreiche Geburt des Tieres würde nicht nur die erste zwischenartliche Klonung darstellen, sondern auch einen weiteren Schritt in Richtung der Herstellung bereits ausgestorbener Tierarten.31 Im Januar 2001 kam es dann tatsächlich zu der Geburt des Gaurs. 2 Tage später ist das Tier jedoch an gewöhnlicher Ruhr, einer Krankheit, die landwirtschaftliche Tiere be-
fällt, gestorben. In 5 anderen Leihmüttern, mit denen das Experiment durchgeführt wurde, kam es zu Spontanaborten. Wissenschaftler glauben jedoch nicht, dass der durch Krankheit herbeigeführte Tod, als Folge der zwischenartlichen Klonung eingetreten ist, und sind gegenüber weiteren Versuchen auf diesem Ge-
biet, eher optimistisch eingestellt.32
3.5.6. Klonen von Affen
3.5.6.1. Tetra
Es wurden zwar bereits Affen mit der Roslin Methode geklont, da die Erfolgs-
quote aber so gering war, ist dieses Thema erst im Januar 2000 wieder interes-sant geworden als Wissenschaftlern aus Oregon gelungen ist, mit der Embryo-Spaltungs-Methode den Klon ei-nes weiblichen Rhesusaffen zu produzieren. Sie gingen dabei auf folgende Weise vor. Zu-nächst wurden das Ei einer Mutter und das Sperma eines Vaters dazu benutzt, eine be-fruchtete Eizelle herzustellen (Abb.3.1). Dann, nachdem die Zygote zu einem 8-Zellen Embryo herangewach-
sen war (Abb.3.2), spal-teten sie diesen in 4 gleich große Embryos, diesen in 4 gleich große Embryos, von denen jedes jeweils 2 Zellen enthielt (Abb.3.3). Schließlich wur-den die Embryos in 4 verschiedene Leih-mütter implantiert, und ausgetragen. Über-lebt hat jedoch nur ein Tier, Tetra, was so-viel heißt wie ,,eins von vier\". Durch das Gelingen dieses Experiments erhofften sich die Wissenschaftler, wenn es erst mal mög-lich wäre Affen genetisch zu verändern, an Therapiemöglichkeiten für Krankheiten wie Alzheimer, besser forschen zu können als bisher an Mäusen, derer Physiologie sich Abb.4: Entstehung von Tetra
sehr von der des Menschen unterscheidet.33
3.5.6.2. ANDi
Fast genau ein Jahr später gelang es Wissenschaftlern einen genetisch veränderten Affen herzustellen, ANDi. Der Name leitet sich von der umgedrehten Abkürzung iDNA ab, welche für ,,inserted DNA\" steht. Bei dem Vorgang fügten die Wissenschaftler ein Quallen-Gen ein, welches ein, bei Blaulicht, grün fluoreszierendes Protein GFP kodiert. Das Quallen-Gen ist ein beliebtes Werkzeug zur Überprüfung ob eine genetische Veränderung stattgefunden hat. In diesem Fall hat man das Gen zuerst in Retroviren eingeschleust. Die Retroviren hat man dann Hunderte von unbefruchteten Eizellen befallen lassen, und somit das Gen in die DNA der Eizelle gebracht. Danach wurden die Eizellen mit Affen-Sperma befruchtet, und die daraus hervorgegangenen Embryos in Leihmütter eingepflanzt. Die Erfolgsquote war in diesem Experiment, mit 1 von 222, sehr gering, und die Zukunft die-ser Methode wurde von vielen Wissenschaftlern in Frage gestellt. Nicht zuletzt deswegen weil Retroviren eine bestimmte Kapazität besitzen, wodurch längere Gene, wie zum Beispiel das für Alzheimer, nicht auf diese Weise eingeschleust werden könnten. Des weiteren wurde versichert, dass man noch weit davon entfernt sei mit dieser Technik wirklich nützliche Affenklone herzustellen, und somit noch viel weiter davon entfernt Menschen genetisch zu manipulieren.
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