Veränderung des chromatogramms:

7.1. Änderung des Elutionsmittel:>
Wasser, Acetonitril und Methanol sind die gängigsten Lösungsmittel in der HPLC. Wasser wird häufig mit Puffersubstanzen versetzt, um einen bestimmten pH-Wert einzustellen. Das Wasser sollte frei von organischen Rückständen und Keimen sein. Wasser besitzt eine Viskosität von 1,00 mPas und hat damit die höchste Viskosität von den drei oben genannten Lösungsmittel. Außerdem hat Wasser die höchste Polarität (vor allem mit Puffersalzen) und damit die geringste Elutionskraft in der RP-Chromatographie. Acetonitril besitzt eine niedrige Viskosität (0,37 mPas) und wird deshalb gerne als Wasser/Acetonitril-Mischung verwendet. Da organische Lösungs-mittel wie Acetonitril sehr viele Gasblasen bilden, wird durch die Mischung mit Wasser die Gasblasenbildung verringert. Acetonitril besitzt in der RP-Chromato-graphie eine mittlere Elutionskraft. Genauso wie Acetonitril ist auch Methanol giftig. Methanol besitzt als Mischung mit Wasser eine sehr hohe Viskosität, die über der Viskosität von reinen Wasser liegt. Methanol besitzt im Gegensatz zu Acetonitril Protonendonatoreigenschaften.
Nach einem Chromatographie-Lauf mit einem Lösungsmittel mittlerer Elutionskraft, kann man die k\'-Werte berechnen. Sollten man kleine k\'-Werte besitzen, so kann man mit einem Lösungsmittel bzw. -gemisch eluieren, das eine geringere Elutions-kraft als das vorherige Lösungsmittel besitzt. Ein stärkeres Elutionsmittel ist notwendig, wenn man große k\'-Werte hat.
In wenigen Ausnahmefällen kann man tenäre Lösungsmittelgemische verwendet. Dies sind Lösungsmittelgemische, die drei verschiedene Lösungsmittel besitzen. Ein drittes Lösungsmittel wird meistens benutzt, um Substanzen mit bestimmten funktionellen Gruppen schneller zu eluieren oder zu verzögern.


7.2. Temperatureinflüsse:

Durch eine Temperaturerhöhung wird bei den meisten Lösungsmitteln ein Ver-kürzung der Analysenzeit bewirkt. Durch die schnellere Analysenzeit werden die Peaks zwar enger zusammengerückt und die Auflösung sinkt, aber durch die Temperaturerhöhung können verdeckte Peaks erscheinen. Außerdem sinkt die Viskosität bei höheren Temperaturen.


7.3. Gradientenläufe:

Wird während eines Chromatographie-Laufes keine Änderung am chromato-graphischen System vorgenommen, so bezeichnet man dies als isokratischen Lauf. Will man die Analysenzeit beschleunigen, so kann man während des Laufes die chromatographischen Bedingung ändern. Die meisten HPLC-Maschinen werden mit Gradienten ausgerüstet. Es gibt verschiedene Arten von Gradienten: Lösungsmittel-, Durchfluß- und Temperaturgradienten.


Lösungsmittelgradienten:

Bei einem Lösungsmittelgradienten wird die Zusammensetzung des Gemisch während des Chromatographie-Laufes verändert. Werden in einem Chromato-gramm einige Peaks schnell eluiert und andere sehr lange verzögert, kann die Laufzeit über einen Lösungsmittelgradienten verbessert werden ohne die Auflösung wesentlich zu verschlechtern. Man ändert die Zusammensetzung des Lösungsmittelgemisches, nachdem die schnellen eluierten Peaks detektiert worden sind. Die neue Zusammensetzung sollte eine höhere Elutionskraft besitzen, damit die letzten Peaks schneller eluiert werden.


Durchflußgradienten:

Bei einem Durchflußgradienten wird die Flußrate während einer Chromatographie verändert. Wird am Anfang der Chromatographie eine niedrige Flußrate eingestellt, so werden die ersten Peaks in der Auflösung verbessert. Durch eine Erhöhung der Flußrate werden die restlichen Substanzen schneller durch die Säule transportiert.


Temperaturgradienten:

Beim Temperaturgradienten wird während des Laufes die Temperatur verändert. Dabei muß für jeden Lauf die Temperatur gleich schnell steigen, um verwertbar Ergebnisse zu bekommen. Es ist wichtig, nicht nur die Säule, sondern auch die mobile Phase vor der Probenaufgabe zu temperieren.