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5.1. Mobile Phase:
Die mobile Phase darf keine Luft enthalten. Unter hohem Druck würden Sauerstoff und andere Gase den Abbau des Elutionsmittels oder der Probe verursachen. Außerdem sinkt die Effizienz der Säule und der Detektor fängt an zu rauschen. Also muß die mobile Phase entgast werden.
Die mobile Phase muß außerdem partikelfrei sein, da es sonst zur Blockierung der Säule kommen kann, was eine große Druckerhöhung nach sich zieht. Deshalb muß die mobile Phase filtriert werden, um sie partikelfrei zu bekommen.
Für die HPLC sind nur Lösungsmittel zu verwenden, die extra für die HPLC ausgewiesen sind.
Das Vorratsgefäß mit der mobilen Phase wird in ein Ultraschallbad gestellt. Bei Lösungsmittelgemischen sollte man mit einem Rührer für ein gute Mischung sorgen. Das Ultraschallbad bleibt solange eingeschaltet bis keine Bläschen mehr aufsteigen. Das erfordert eine Zeit von ca. 5-10 Minuten. Eine weitere Methode zur Entgasung ist die Verwendung vom vermindertem Druck. Zur Entfernung von Partikel sollte eine Membranfiltration erfolgen.
5.2. Probenvorbereitung:
Um eine quantitative Aussage machen zu können, muß man vor der Hauptprobe Kalibrierungsproben laufen lassen. Dazu wägt man die zu analysierende Substanz in einen Meßkolben ein und löst sie in einem Lösungsmittel (am besten in dem Elutionsmittel). Die Konzentration sollte im linearen Bereich liegen. Liegt die Konzentration zu hoch, kann man die Lösung verdünnen.
Die Probe wie auch die Kalibrierungsproben werden filtriert, da sonst nach der Injektion die Säule verdreckt sein könnte und damit die Trennleistung verringert wird. Die Probe wird über eine Spritze aufgesogen. Auf die Spritze wird ein Membranfilter gesetzt, der Lösungsmittel beständig sein muß und die zu analysierenden Substanzen nicht adsorbiert. Nun filtriert man die Probe in eine neue Vorlage, aus der die Injektion mit der Injektionsspritze erfolgt.
5.3. Injektion der Probe:
Für eine genaue Messung darf weder die Injektionsspritze noch die Probe verun-reinigt sein. Die Spülung der Spritze sollte bei organischen Lösungsmitteln (als mobile Phase) mit Methanol und bei wäßrigen Lösungsmitteln mit dest. Wasser erfolgen. Die Probe sollte mehrmals mit der Injektionsspritze aufgesogen und herausgelassen werden. Für die Probeneinspritzung dürfen keine Blasen in die Injektionsspritze gelangen. Man saugt mit der Spritze mehr als das doppelte des Volumens der Dosierschlaufe auf. Man dreht die Spritze mit der Nadel nach oben und stellt das doppelte Volumen der Dosierschlaufe ein. Als letztes wischt man die Nadel vorsichtig ab.
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