Maria Stuarts Hinrichtung hatte schwerwiegende Folgen. Bereits seit längerem hatte Elisabeth die Übergriffe englischer Freibeuter wie z. B. Francis Drake auf spanische Schiffe und spanischen Kolonialbesitz unterstützt, und sie ließ den Niederlanden in ihrem Freiheitskampf gegen Spanien Hilfe zukommen. Die Hinrichtung der Katholikin Maria lieferte nun dem ebenfalls katholischen spanischen König Philipp II., der sich im Übrigen nach dem Tod seiner zweiten Frau Maria I. Tudor um eine Eheschließung mit Elisabeth bemüht hatte, nur noch einen weiteren Grund, den Krieg gegen England, der schon seit 1585 vor allem in den Niederlanden geführt wurde, fortzusetzen und zu verschärfen. 1588 entsandte er eine gewaltige Flotte zur Invasion Englands.
Der Plan zur Eroberung Englands hatte politische und religiöse Gründe: Philipp, Herrscher über das katholische Spanien, versuchte seit 1566 erfolglos, einen Aufstand seiner protestantischen Untertanen in den Niederlanden niederzuwerfen. Die Aufständischen wurden von England offen unterstützt. 1586 kam Philipp schließlich zu dem Schluss, dass er die Niederlande nur besiegen könne, wenn er England unterwerfe. Gleichzeitig hoffte er, durch die Absetzung Elisabeths und die Rekatholisierung des protestantischen Englands die seit langem bestehenden konfessionellen Zwistigkeiten mit England zu seinen Gunsten zu entscheiden.
Geplant war, dass eine spanische Flotte unter dem Oberbefehl des Herzogs von Medina-Sidonia, Alonso Pérez de Guzmán, zusammen mit einem Heer aus den Niederlanden unter der Führung Alessandro Farneses in England einfallen sollte. Die Flotte bestand aus 130 Schiffen mit fast 30 000 Mann Besatzung. Die Engländer erhielten jedoch Kenntnis von diesem Plan und verzögerten das Auslaufen der Armada durch Angriffe auf Cádiz (1587) für fast ein Jahr.
Im Juli 1588 konnte die Armada schließlich in See stechen. Am 29. Juli wurde sie vor England gesichtet. Eine englische Flotte unter Lord Charles Howard (dem späteren 1. Earl of Nottingham) stellte sich ihr bei Plymouth entgegen und lieferte den Spaniern in der folgenden Woche Schlachten vor Plymouth, Portland Bill und der Insel Wight. Die englische Flotte war der spanischen zahlenmäßig unterlegen, aber ihre Schiffe waren schneller und wendiger, außerdem war ihre Artillerie der spanischen überlegen. Die ersten Schlachten endeten unentschieden.
Die Gelegenheit zum entscheidenden Schlag bot sich den Engländern, als die Armada bei Calais (Frankreich) vor Anker ging, um hier die Truppen aus den Niederlanden an Bord zu nehmen: Howard ließ brennende Schiffe auf die Armada zufahren. Dadurch brach bei den Spaniern eine Panik aus, die zur Auflösung ihres Flottenverbands führte. In der folgenden Schlacht bei Gravelines am 8. August trugen die Engländer den Sieg davon. In der Folge verhinderten starke Stürme die Rückfahrt der spanischen Schiffe durch den Ärmelkanal; die Armada musste deshalb den Weg um die Nordküste von Schottland und die Westküste von Irland nach Spanien zurück nehmen. Nur 67 der ursprünglich 130 Schiffe kamen in Spanien an, die meisten davon schwer beschädigt.
Die Niederlage der Armada bedeutete jedoch noch kein Ende des Krieges zwischen England und Spanien - der Krieg sollte noch bis 1604 andauern -; die Niederlage stärkte jedoch das englische Nationalgefühl, festigte die Stellung des Protestantismus als Staatsreligion in England, schuf die Grundlage für das Vertrauen der Engländer in ihre Flotte, dem zentralen Instrument zur Verteidigung ihres Landes, und sie wurde von vielen als Beginn des Aufstiegs Englands zur Weltmacht interpretiert. Spanien dagegen trieb die Niederlage beinahe in den Bankrott.
Die Spanische Armada wurde jedoch von der englischen Flotte vernichtend geschlagen, und England begann Spanien als führende See- und Kolonialmacht abzulösen. Gleichzeitig etablierte England mit seinem Sieg über das katholische Spanien den Protestantismus als nicht mehr zu übergehenden Faktor in der internationalen Politik. Der Sieg über die Armada war eine der großen Leistungen Königin Elisabeths I. von England und trug in der Folge zum Zerfall des Spanischen Reiches bei.
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